转自：药时空
疫苗的发明一直被视为医学研究的重要里程碑之一，也是科学的一大胜利成果。疫苗接种不仅有效遏制了传染病的大面积传播，部分疫苗甚至为接种者提供了终身保护。在科学进步的同时，疫苗开发中的挑战也更艰巨，在开发针对包括鼠疫、结核病、疟疾、人类免疫缺陷病毒（HIV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）等多种传染病的理想疫苗的过程中，众多研究团队正在不断地提升疫苗的效果，尝试跨过免疫反应不足和免疫记忆减弱等人体免疫障碍的问题。
除了免疫障碍之外，疫苗的安全性问题也备受关注。例如，部分疫苗对患有罕见遗传疾病的人群可能产生不良影响，而白喉和破伤风类毒素以及全细胞百日咳（DTwP）疫苗可能引起全身和局部不良反应。此外，白喉和破伤风类毒素以及无细胞百日咳（DTaP）疫苗可能导致免疫力下降，这些安全性问题都需要解决。而新出现或反复出现的传染疾病威胁，所需应对的疫苗问题的挑战。
近年来，全球科学界目睹了多起重大疾病爆发事件，包括2003年的非典疫情、2009年的H1N1流感大流行、2014年的埃博拉病毒爆发、2017年马达加斯加的鼠疫、2018年印度的尼帕疫情，以及前不久结束的COVID-19大流行。特别是2014年的埃博拉疫情在发达国家引发了巨大的恐慌，因为西非国家的死亡率相当高。这些事件迫使科学界不断寻求针对这些新兴病原体开发有效疫苗的技术和方法。
目前，人类可用的四种疫苗包括灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗。
减毒活疫苗可以在宿主体内复制并引发强烈的免疫反应，对多种疾病有效。
灭活疫苗是通过灭活病原体，具有非传染性和较弱的短期免疫，需要加强剂量以达到完全保护。
亚单位疫苗只包含病原体的抗原部分，需要添加成分增强免疫原性，已有多个成功的亚单位疫苗，如乙肝、流感和百日咳疫苗。
核酸疫苗是基于mRNA技术，通过指导抗体产生提供免疫反应，在COVID-19大流行中起到重要作用。
对佐剂的需求
佐剂最早是由法国科学家加斯顿·雷蒙于1920年发现的，他在研究结果中观察到，在疫苗中加入铝盐增强了疫苗的效果。“佐剂”一词源于拉丁语“adjuvant”，意为“辅助剂”。佐剂一般不具有免疫原性，但它们可以在疫苗配方中调节免疫反应，不仅减少了疫苗所需的剂量，而且还扩大了免疫记忆。通常，使用适当的佐剂配制的疫苗可以增强对所注射的疫苗抗原的免疫反应，以评估阻止传染病的可能性。佐剂的另一个重要作用是引导体液和细胞免疫反应，以产生病原体特异性免疫。
佐剂的开发，主要是为了达成以下几个目的：
(A) 增强特定疫苗的免疫反应，并提升抗体反应和疫苗接种覆盖率；
(B) 提高因年龄、疾病或治疗干预而导致免疫反应减弱的个人的血清转换率，例如，将MF59佐剂与流感疫苗联合使用，以改善老年人的免疫反应；
(C) 通过减少疫苗抗原的剂量和增加佐剂的数量，以实现以较少疫苗抗原产生类似免疫反应的能力，这在疫苗生产设施有限和一般公共卫生突发事件中的作用极为重要。
(I) 提供适当的免疫反应功能，如体液或细胞免疫反应类型（如Th1、Th2和Th17）。此外，平衡的Th1/Th2/Th17反应观察到可以延长T细胞反应的持续时间，并延长小鼠的存活时间；
(II) 增强长期记忆细胞的形成，例如T细胞记忆；
(III) 提供在大流行病中必不可少的初始快速反应；
(IV) 改善免疫应答的广度、特异性或亲和力（见图1）。
佐剂
作用特点和作用机制
01
铝盐(明矾)
Aluminum salts (alum)
铝盐是一种被广泛使用的疫苗佐剂，已有80多年的应用历史，主要用于吸附疫苗抗原并刺激免疫反应。明矾是一种常见的铝盐佐剂，已被批准用于多种人类疫苗。明矾作为佐剂通过刺激B细胞分化以增加抗体产生，并激发先天免疫反应。此外，明矾还通过树突状细胞启动信号级联反应，并调节补体蛋白级联来发挥作用。明矾作为佐剂具有安全性、疫苗抗原稳定性和调节抗体效价的优势。
02
乳剂形式佐剂(水包油)
Adjuvants in emulsion forms (oil-in-water)
（1）MF59和AS03佐剂
分化后的免疫细胞转化为抗原呈递细胞，以激活B和T细胞，传授强大的体液和细胞免疫反应。
AS03：是一种水包油乳剂，主要成分包括角鲨烯、α-生育酚和聚山梨酸酯。它首次用于疟疾疫苗的配方，最近也被用于人类流感疫苗。临床试验表明，AS03佐剂可引起强烈的免疫反应，在婴儿中尤甚。AS03佐剂通过刺激核因子kappaB和趋化因子来激发免疫力，招募免疫细胞。
相比传统流感疫苗，使用AS03佐剂可以以较低剂量的疫苗抗原产生强烈的体液免疫反应。自2009年以来，已有大量儿童接种了AS03佐剂甲型H1N1流感疫苗。
（2）军队脂质体制剂
该配方由美国军方开发，包含胆固醇和含有饱和磷脂和单磷脂A的脂质体。军队脂质体制剂(ALF)有几种改进的形式，包括ALF吸附在氢氧化铝(ALFA)上、含有QS21皂苷的ALF(ALFQ)和ALFQ吸附在氢氧化铝(ALFQA)上。研究发现，疫苗候选恶性疟原虫环孢子虫蛋白与α佐剂可产生免疫反应。
沃尔特里德陆军研究所疟疾疫苗分部开发并测试了FMP013和FMP014与ALFQ佐剂的保护效果。α佐剂的重组gp120可诱导抗不同亚型HIV-1的交叉反应抗体。ALF和ALFQ在免疫反应类型上有所不同，ALF主要诱导Th2型免疫反应，而ALFQ诱导平衡的Th1和Th2型免疫反应。ALFQ佐剂还可激活先天免疫反应，提高抗HIV蛋白APOBEC3的水平，并维持促炎环境，从而限制HIV-1感染。
03
病毒体(脂类和糖蛋白)
Virosomes (lipids and glycoproteins)
病毒体是一种具有佐剂系统属性的小型球状脂质囊泡，以其可生物降解和无毒特性而闻名。病毒体不产生抗病毒小体抗体，它内嵌有病毒包膜蛋白（如流感病毒的神经氨酸酶和血凝素）。病毒体通过与细胞受体结合，将疫苗抗原直接运送到靶细胞，激发抗原特异性免疫反应。
病毒体可以引发B细胞和T细胞免疫反应，并且已经成功应用于甲型肝炎和流感疫苗中。这种新一代疫苗具有高效、安全的特点，适用于免疫抑制的患者和婴儿。
04
铝吸附TLR-4受体激动剂AS04
alum-adsorbed TLR-4 agonist
为了开发新的佐剂系统，研究人员采用铝盐作为载体，并将不同的Toll样受体(TLR)激动剂吸附在明矾上。佐剂系统04(AS04)已经获得批准用于乙肝疫苗(Fendrix)等的配方中。该佐剂系统包括明尼苏达州沙门氏菌3-O-去酰基-4‘-单磷酰基脂A(3-O-Desacyl-4’Monphoryl Lipal A，MPLA)与脂多糖的配方中的明矾。
文献报道显示，MPLA通过与TLR-4相互作用，保留了刺激先天免疫的能力。这进一步导致诱导核因子-kB信号，并产生促炎细胞因子和趋化因子，从而在疫苗接种部位和引流淋巴结处招募免疫细胞。在接种后几个小时内，单核细胞和树突状细胞的数量增加，并相互作用，刺激抗原特异性T和B细胞，从而产生强大的细胞和体液免疫反应。明矾与MPLA之间没有显示出协同作用，但一项比较研究表明，明矾延长了MPLA在疫苗接种部位引起的细胞反应。
研究结果表明，AS04佐剂可通过刺激TLR-4，诱导先天性免疫反应。与明胶佐剂相比，AS04佐剂的乙肝疫苗在人类体内引起更高水平的IL-6和C反应蛋白。但在明矾配方中，报告的HBs抗原特异性T细胞和抗体水平比乙肝疫苗诱导的更高。与使用明矾佐剂配制的相同疫苗相比，使用AS04配方的乙肝疫苗和HPV疫苗都能够激发更强的体液免疫反应，这进一步证明了TLR4激动剂MPLA佐剂在人类使用中的重要性。
05
RC-529佐剂
RC-529 adjuvant
脂多糖的酸碱水解产生多聚乳酸，保留了脂多糖的免疫刺激功能。Mpla是一种已批准的佐剂，可激活和刺激DC的成熟，并增强免疫反应。合成模拟物RC-529也是一种有效的佐剂，可提高抗体产生，并在临床试验中被发现安全有效。
佐剂
在黏膜疫苗中的应用
佐剂能够激发宿主的天然免疫系统，有助于提供对病原体的保护。全细胞疫苗通常采用活减毒或灭活病原体，并含有内源性佐剂，如细菌细胞壁产物和基因组DNA/RNA。这些佐剂作用于致病相关分子模式（PAMP），能够刺激适应性免疫。然而，亚单位疫苗通常缺乏或无法引发先天免疫反应，因此，包含佐剂对于成功的疫苗提供是必不可少的。大多数病原体通过鼻腔或口腔途径进入宿主。因此，有效的黏膜疫苗对于预防这类黏膜传播疾病至关重要。
与肌肉内或亚单位疫苗相比，黏膜疫苗具有显著的优势，如低成本、非侵入性，并且最重要的是，血液传播感染的风险非常低，这一优势对幼儿尤为重要。但由于缺乏理想的黏膜佐剂，只有少数几种黏膜疫苗获批用于人类。
黏膜佐剂需要同时起到两个作用：“输送载体”和“免疫激活分子”。激活保护性免疫的作用对黏膜免疫预防传染病很重要。黏膜佐剂还可用于抗肿瘤免疫，其中，TLR激动剂和突变肠毒素是常用的安全有效的黏膜佐剂类型。细菌衍生的ADP核糖化肠毒素是最具刺激细胞和体液免疫反应优势的黏膜佐剂，能够产生长期记忆细胞和IgA抗体。
01
不耐热毒素/双变种不耐热毒素黏膜佐剂如何作用？
How do heat-labile toxin/doublemutant heat-labile toxin mucosal adjuvants work?
黏膜佐剂LT是一种多聚体蛋白，可以增强疫苗在黏膜免疫中的效果。它通过增加疫苗抗原的摄取率，提高黏膜免疫反应。该佐剂可用于输送疫苗到难以接触的部位，同时降低了通过注射传播疾病的风险。在动物模型中，它显示出激发强烈免疫反应的潜力，但在人类中的使用还需进一步验证。
最近的研究已详细描述了LT、CT及其变种——LT和CT是活性形式为AB5的亚基，具有独特的佐剂功能。B亚基与受体结合并引导进入细胞，帮助将疫苗抗原输送到黏膜部位；而A亚基与ADP核糖化因子结合，导致环磷酸腺苷积累。
LT刺激DC的激活、细胞因子的表达和Th17反应的刺激。LT的A亚基可引起混合的Th1/Th2/Th17型免疫反应，但比活跃的AB5型LT的影响更弱。B亚基的使用可引起Th2/T调节细胞偏斜反应，而毒性一直是这些佐剂的研发过程中不可忽视的问题。
图3描绘了DmLT佐剂诱导免疫系统免疫级联反应：
(I)疫苗接种部位吸收疫苗抗原后，先天免疫系统被激活。上皮细胞分泌细胞因子和趋化因子，如IL-8和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。
(Ii)树突状细胞被招募到疫苗接种部位并被激活，行抗原处理并呈递给主要组织相容性复合体(Ag-MHC)。CD80和CD86表达上调，极化细胞因子如IL-1、IL-23、IL-6和G-CSF分泌增加。
(Iii)携带疫苗抗原的活化树突状细胞随后迁移到次级淋巴器官，促进抗原特异性辅助T细胞和B细胞分化为分泌IgA和IgG抗体的浆细胞。
(II) 树突状细胞（DCs） 被激活并被招募到注射部位， 在那里它们处理并呈现抗原。它还上调了成本刺激分子， 即CD80和CD86， 并刺激了IL-1、 IL-6、 IL-23和G-CSF的表达。
(III) 被激活的DCs迁移到二级淋巴器官，在那里刺激分泌抗体的浆体B细胞的分化和产生抗原特异性Th细胞。
总的来说，Th17被赋予了强大的免疫反应。Th17细胞在免疫和刺激二级淋巴器官生发中心的形成以及加强IgA的分泌方面是必不可少的
经LT/dmLT佐剂刺激的DC通过激活caspase 1炎症体以及趋化因子和细胞因子的表达，诱导了高水平的Th17型免疫应答。LT激活的小鼠DC诱导IL-1b的表达，这对于产生Th17细胞至关重要。人外周血单个核细胞(PBMC)再刺激疫苗抗原免疫后，可以增加IL-17A和IL-13的表达。dmLT在疫苗免疫中起到了APC和疫苗免疫的有效刺激作用。
02
作为黏膜疫苗佐剂的TLR激动剂
TLR agonists as a mucosal vaccine adjuvant
基于TLR配体的佐剂配方可以触发和激活先天免疫反应，有助于增强候选疫苗的保护潜力。这种佐剂需要与MyD88蛋白相互作用，以刺激抗原呈递细胞（APC）和B细胞产生抗体。此外，MyD88信号还能诱导生发中心的形成，而生发中心对于产生抗体分泌细胞至关重要。基于TLR配体的佐剂包括TLR9依赖的CpG DNA（CpG）和TLR2依赖的Porin B（PorB）。这两种佐剂在适当刺激APC时都需要与MyD88相互作用（CpG是一种未甲基化的细菌DNA序列，而PorB是脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白）。
TLR激动剂作为疫苗佐剂，主要作用是刺激APC细胞（巨噬细胞、DC和B细胞）产生免疫反应。TLR4配体已被用于临床前研究和临床试验，如卡介苗和Mpla。在小鼠模型中，TLR4激动剂可诱导急性炎症和肿瘤消退。另外，TLR1/2和TLR3激动剂联用的L-PAMPO在雪貂模型中引起强烈的免疫反应。口服SARS-CoV-2疫苗使用双链RNA佐剂，通过激活TLR3帮助激活DC群体。这些研究为疫苗设计提供了新的希望。
佐剂
临床试验的现状
在开发新型疫苗佐剂的过程中，安全性一直是人们极为关注的问题，因此，许多佐剂在临床前和临床研究中都经过了全面的评估。现已广泛使用的佐剂明矾早年首先在美国已经获得了批准，并且在70多年前就开始被应用于疫苗领域；1997年，基于乳剂的疫苗佐剂MF59在欧洲获批用于制备流感疫苗；基于乳剂的疫苗佐剂AS03于2009年获批与流感疫苗一同使用；2000年脂质体佐剂之一的病毒体获批成为甲型肝炎和流感疫苗的基本组成部分；含有吸附在明矾上的MLA的组合佐剂AS04已在欧洲获得批准，并在美国获批。表1列出了获准用于人类的佐剂。
表1.已获批用于人类的佐剂
高纯度疫苗抗原虽然具有成本低、产量高、安全性好等优点，但其免疫潜力较弱，缺乏内在免疫刺激因子。PAMP（革兰氏阴性细菌的脂多糖）可以刺激免疫细胞受体（如TLR），协调和调节先天免疫反应和获得性免疫反应。佐剂被确定为刺激先天免疫细胞上特定受体的物质，可以感知危险信号和细胞压力。早期开发的佐剂由于反应性高、耐受性差而无法应用。不同佐剂的组合可协同促进广泛的免疫反应，提供更好的体液和细胞免疫反应选择。这些组合包括传递系统（如脂质体、明矾或乳剂）、天然免疫激活剂与免疫增强剂（如细菌mpla、病毒dsRNA或植物Quillaja皂苷）。
新一代佐剂大多被称为免疫激活剂或免疫增强剂，基本已进行了人体测试，并正在进行表2所列的临床试验。这些新一代佐剂系统是根据现有的药物输送模型和既定的药学原则设计的，实施的递送系统主要是免疫信号激活，可以定位并集中在协同疫苗抗原的水平提升上。葛兰素史克的佐剂系统(AS)是这一进步的最好范例。
临床研究数据显示，佐剂在疫苗中起到重要作用。它们能迅速刺激免疫反应，促进免疫细胞的招募和激活。通过靶向激活的抗原呈递细胞，可以有效诱导疫苗抗原特异性T细胞的产生。抗原特异性T细胞的类型取决于先天免疫信号的激活性质。佐剂系统可以调节抗原特异性T细胞的克隆排列和质量，从而增强疫苗的效果。
诺华公司从Soapbark树皮中提取的皂苷化合物中开发的基质-M也是一种重要的佐剂，目前应用于新冠疫苗的配方中，并正在进行I期临床试验。基质-M能诱导高中和抗体滴度的产生，同时能引发强大的T细胞免疫反应，对冠状病毒具有保护作用。除新冠疫苗外外，基质-M也用于疟疾和流感疫苗等其他疫苗配方。皂苷类佐剂的机制虽仍在研究中，但已观察到其在激活天然免疫系统中起关键作用，能节省疫苗使用剂量并诱导免疫反应。
佐剂的开发机制、方法和原理与佐剂疫苗在人体内的有效性和可接受性密切相关。这一信息对于评估和表征新的佐剂系统的方案，以进行非临床模型和临床中的Vis-to-Vis比较可能具有帮助。最新研究表明，五种不同的佐剂疫苗仅对针对疫苗抗原的CD4+T细胞数量产生影响，而无法调节这些细胞的表型范围。因此，佐剂并不总是影响对所有抗原的免疫反应质量的因素。一般而言，HIV疫苗等疫苗效力仍然高度依赖于疫苗抗原本身以及所需的免疫保护类型。
佐剂
实际使用及未来展望
时至今日，我们已经在免疫学方面对新一代佐剂取得了许多新的发现，这些发现可能有助于通过通过选择合适的佐剂和抗原组合来开发新型佐剂疫苗，并利用组学和系统生物学的方法来解释理想疫苗所引发的复杂人类免疫反应。此外，开发和改进相容的动物模型来评估潜在的佐剂疫苗，并利用非临床研究对新一代佐剂进行快速发展，以在沟通临床解释方面发挥重要作用。
佐剂主要由天然成分组成，但随着生物化学技术的不断发展，新的合成佐剂也在同步开发中，且同样可能成为更有效的激活剂和激动剂，并且可以低成本有效地批量生产。然而，在使用这些新的佐剂候选制剂的疫苗的临床试验中，需要解决对安全性和保护效果的担忧。
在过去的100年里，虽然人们研究了多种有希望的佐剂候选者，但只有少数被批准用于人类。醋酸钙不动杆菌产生的酰化多糖乳胶具有适应性和乳化行为，是一个有潜力的候选者。除此之外，乳清能激活巨噬细胞，并且显示出显著的佐剂活性，特征是高滴度的免疫球蛋白G2a，与Th1反应一致。乳胶作为一种新的候选佐剂，展示了显著的免疫增强作用。通过操纵乳胶的化学结构，可以进一步探索PRRs和巨噬细胞激活的物理基础。
近年来，对天然免疫信号的研究取得了深入的了解，使多个潜力佐剂靶标，如TLR、STING、RIG-I、CLRs、NLRP和AIM2逐渐登上疫苗开发的舞台。而包括多聚体配方在内的复杂的探索性佐剂概念，尽管在理想的预防性疫苗中得作用有限，但在解决批量生产、稳定性和重复性等问题后，可能在治疗性疫苗中获得更多机会。
佐剂仍有包括无法引发强烈的CTL反应在内的局限性。不过，为了刺激广泛和多样化的免疫反应，佐剂也可以用于核酸和载体的引发或增强。已经有尝试利用PRIME/BOOST技术开发HIV疫苗，并在评估载体引发后使用佐剂增强蛋白的疫苗抗原。因此，临床研究对于确定最佳的疫苗成分组合至关重要。
免疫接种的目标是提供有效和持久的保护，通过使用含有适当佐剂和抗原的疫苗配方来实现。新的疫苗配方需要新的免疫增强剂或免疫刺激剂佐剂，如黏膜佐剂dmLT，已被证明能够诱导保护性免疫的安全有效的佐剂，特别在婴儿中可能有极大的未来前景。在未来，dmLT有望在婴儿疫苗制备中发挥重要作用。
当下，不仅有许多新的佐剂理论得到研究，新型佐剂也已在各种流行疾病的应对中大放异彩。基于蛋白质疫苗结合佐剂的疫苗制备将具有良好的耐受性、有效性和大规模可获得性。新一代佐剂的研究将为成功疫苗的开发提供合理的战略。面对开发中的种种挑战，我们需要采取新的策略来帮助我们更好地理解免疫反应，并引入新的技术工艺，在保证质量和安全性的前提下，诱导出强大的免疫效果。